PCR技術(shù)的定量原理: 擴增曲線 在Real- qPCR中,對整個PCR反應(yīng)擴增過程進行了實時的檢測并記錄其熒光信號,隨著反應(yīng)的進行,監(jiān)測到的熒光信號可以繪制成一條曲線,即為擴增曲線。熒光擴增曲線一般分為基線期、指數(shù)增長期和平臺期。 在Real-time qPCR擴增早期,擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋,無法判斷產(chǎn)物量的變化,此時即為基線期。 PCR反應(yīng)過程中產(chǎn)生的DNA拷貝數(shù)是呈指數(shù)形式增加的,隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)的增加,終PCR反應(yīng)不再以指數(shù)形式生成模板,從而進入“平臺期”。在該時期,擴增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加,PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間無線性關(guān)系,所以根據(jù)終的PCR產(chǎn)物量不能計算出初始模板量。 熒光染料的優(yōu)點: 產(chǎn)品僅用于科研使用簡便; 可以與任何PCR產(chǎn)物結(jié)合; 價格便宜; 熒光染料的缺點: 不能區(qū)分不同的雙鏈DNA 引物二聚體會影響檢測的敏感性 非特異性產(chǎn)物會影響結(jié)果的敏感性 引物二聚體和非特異性擴增問題可以通過熔解曲線 (Melting curve) 進行識別,進而通過PCR引物的設(shè)計和反應(yīng)條件的優(yōu)化得以解決??偟膩碚f,SYBR Green I方法是一種基礎(chǔ)也的Real-time qPCR實驗手段。 產(chǎn)品名稱 | 人皰疹病毒4型探針法熒光PCR檢測試劑盒 | 英文名稱 | Human Herpesvirus 4 (HHV-4,EB) )4 | 貨號 | YSP96821 |
? 熒光探針: Real-e qPCR中的熒光探針為TaqMan探針,其基本原理是依據(jù)目的基因設(shè)計合成一個能夠與之特異性雜交的探針,該探針的5'端標記熒光基團,3'端標記淬滅基團。 正常情況下兩個基團的空間距離很近,熒光基因因淬滅而不能發(fā)出熒光。PCR擴增時,引物與該探針同時結(jié)合到模板上,探針的結(jié)合位置位于上下游引物之間。 當(dāng)擴增延伸到探針結(jié)合的位置時,Taq酶利用5'外切酶活性,將探針5'端連接的熒光分子從探針上切割下來,從而使其發(fā)出熒光。檢測到的熒光分子數(shù)與PCR產(chǎn)物的數(shù)量成正比,因此,根據(jù)PCR反應(yīng)體系中的熒光強度即可計算出初始DNA模板的數(shù)量。 TaqMan探針技術(shù)解決了熒光染料與非特異性擴增結(jié)合的問題,反應(yīng)結(jié)束后無需通過熔解曲線檢測,縮短了實驗時間。 TaqMan探針技術(shù)的優(yōu)點: 熒光背景低; 敏感性高; 雜交穩(wěn)定性高; 熒光光譜分辨率好; 特異性高。 TaqMan探針技術(shù)的缺點: 成本高; 設(shè)計難度大; 只能用于檢測產(chǎn)物長度低于150bp的反應(yīng)。 由于TaqMan探針的高特異性,可用于等位基因的辨別,特別適用于人類基因多態(tài)性以及根據(jù)SNP區(qū)別和定量菌株。 ? 熒光定量PCR原理: 產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR早稱TaqMan PCR,后來也叫Real-Time PCR,是美國PE(Perkin Elmer)公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標記探針或相應(yīng)的熒光染料來實現(xiàn)其定量功能的。其原理:隨著PCR反應(yīng)的進行,PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計,熒光信號強度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán),收集一個熒光強度信號,這樣我們就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化,從而得到一條熒光擴增曲線圖。 一般而言,熒光擴增曲線可以分成三個階段:熒光背景信號階段,熒光信號指數(shù)擴增階段和平臺期。在熒光背景信號階段,擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋,無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺期,擴增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加,PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系,根據(jù)終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴增階段, PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系,我們可以選擇在這個階段進行定量分析。為了定量和比較的方便,在實時熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個非常重要的概念:熒光閾值和 CT值。 特別提示:本公司的所有產(chǎn)品僅可用于科研實驗,嚴禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途! Cetyltrimethylammonium BBerberine (chloride) 瓶 氟喹諾酮(QNS)快速檢測試劑卡(檢雞蛋,檢測限60-100ppb,消線法) Chlortetracycline HCl 質(zhì)量規(guī)格:效價測定 氟喹諾酮(QNS)快速檢測試紙條(檢組織,檢測限5-20ppb,比色法) Cilostazol 質(zhì)量規(guī)格:>99%,USP34 呋喃唑酮(AOZ)代謝物快速檢測試紙條(雞肉/水產(chǎn)品,檢測限0.5ppb,比色法) Cilostazol 質(zhì)量規(guī)格:HPLC>98%,標準品 呋喃妥因(AHD)代謝物快速檢測試紙條(雞肉/水產(chǎn)品,檢測限0.5ppb,比色法) Cisplatin 質(zhì)量規(guī)格:進分Sigma P4394 呋喃西林(SEM)代謝物快速檢測試紙條(雞肉/水產(chǎn)品,檢測限0.5ppb,比色法) Cisplatin 質(zhì)量規(guī)格:>98.5%,細胞培養(yǎng)級,BR β類殘留快速檢測卡(檢尿樣,檢測限3ppb,消線法) Cisplatin 質(zhì)量規(guī)格:HPLC>98%,標準品 呋喃唑酮代謝物(AOZ)快速檢測試劑卡(組織/雞蛋/蜂蜜,檢測限0.5ppb,比色法) Cladribine 質(zhì)量規(guī)格:>99.0%,USP34,BR,可用于細胞培養(yǎng) 替米考星ELISA快速檢測試劑盒(檢雞肉/豬肉,靈敏度0.5ppb,一步法) Clarithromycin 質(zhì)量規(guī)格:>97%,USP34,BR PNPG 對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷別名: 4-Nitrophenyl β-D-glucopyranosideCAS: 2492-87-7純度: ≥98%單位: 瓶 Atropine (sulfate monohydrate) 硫酸阿托品一水別名: Atropine sulfate hydrateCAS: 5908-99-6純度: ≥98%單位: 瓶 Levofloxacin (hydrate) 左氧氟沙星別名:? 人皰疹病毒4型探針法熒光PCR檢測試劑盒蛇毒巴曲酶抗體phospho-GSK-3 Beta(Thr390) /FITC 熒光素標記兔抗、大、葡萄糖合成激酶3β抗體IgG100 ul 大腦蛋白2抗體Phospho-GSK-3alpha (Ser21) /FITC 熒光素標記兔抗、大、等酸化葡萄糖合成激酶-3α抗體IgG100 ul 程序性死亡配體1抗體GSR/GRase/FITC 熒光素標記谷胱甘肽還原酶抗體IgG20 ul B7-H4抗體GST/FITC 熒光素標記重組谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶GST標簽蛋白抗體IgG100 ul β分泌酶抗體OLFM1/FITC 熒光素標記兔抗、大、、馬、雞嗅球蛋白1抗體IgG100 ul 相關(guān)死亡促進因子Bad抗體GST-Tag/HRP 辣根過氧化物酶標記兔抗重組谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶GST標簽蛋白抗體IgG20 ul BaxFLAG Tag (NT)/HRP 辣根過氧化物酶標記FLAG Tag標簽抗體(N端)IgG100 ul 程序性死亡配體2抗體GTP-CH-1/FITC 熒光素標記三酸鳥苷環(huán)水解酶抗體IgG20 ul 膽汁酸鹽輸出泵/ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白11抗體GTSE-1/FITC 熒光素標記G2期、S期應(yīng)答相關(guān)蛋白1抗體IgG100 ul |